jeanni

LAPORAN HASIL PRAKTIKUM

BIOLOGI SEL MOLEKULER

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Oleh

JEANNI NOVA SURBAKTI

P2BA09005

 

 

 

 

 

UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN

FAKULTAS BIOLOGI

PROGRAM MAGISTER BIOLOGI

PURWOKERTO

 

2010

DAFTAR ISI

 

ACARA I. ISOLASI DNA PLASMID

ACARA II. RESTRIKSI DNA PLASMID

ACARA III. ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

ACARA IV. TRANSFORMASI

ACARA I.

ISOLASI DNA PLASMID

LANDASAN TEORI

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.

TUJUAN

Melihat cara kerja isolasi DNA plasmid

BAHAN DAN ALAT

1. E. coli JM109 yang di dalamnya terdapat plasmid pUC19

2. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair

3. Ampisilin

4. QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA)

5. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)

6. Tabung mikrosentrifuga

7. Sarung tangan

8. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

9. Lemari pendingin

10. Kamera Digital

CARA KERJA

DNA vektor pUC19 diisolasi menggunakan QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen, USA).

1. Koloni tunggal bakteri JM transforman pUC19 dinokulasikan ke 25 ml medium LB cair dan diinkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37^oC selama 16 jam (semalam).

2. Kultur bakteri hasil inkubasi 16 jam sebanyak 3 ml diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.

3. Pelet sel diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dan disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.

4. Pelet sel bakteri diresuspensi dengan 250 µl Buffer P1 sampai homogen.

5. Suspensi ditambah 250 µl Buffer P2 dan diresuspensi kembali dengan cara dibolak-balik sebanyak 4-6 kali.

6. Suspensi yang dihasilkan akan berubah warnanya menjadi biru.

7. Suspensi selanjutnya ditambah 350 µl N3 dan diresuspensi dengan cara yang sama sehingga warna suspensi kembali seperti warna awal.

8. Tahap selanjutnya tabung mikrosentrifuga disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm (17,900 x g) selama 10 menit.

9. Supernatan yang dihasilkan dipindah dengan cara memipet ke dalam collection tube yang dilengkapi dengan QIAprep spin column dan disentrifugasi kembali dengan kecepatan 13000 rpm (17,900 x g) selama satu menit.

10. Cairan yang melewati membran dibuang dan QIAprep spin column dimasukkan kembali ke dalam tabung mikrosentrifuga.

11. QIAprep spin column dicuci dengan 500 μl PB dan disentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit.

12. Cairan yang melewati QIAprep spin column dibuang, dan ke dalam QIAprep spin column ditambahkan kembali 750 μl buffer PE, dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 13000 rpm selama satu menit.

13. Cairan yang melewati QIAprep spin column kembali dibuang dan disentrifugasi ulang untuk menghilangkan sisa buffer pencuci.

14. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml baru dan ditambah dengan 50 μl buffer EB, dan dilanjutkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi pertama).

15. QIAprep spin column dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga 1,5 ml yang lain dan ditambah dengan 50 μl buffer EB. Tabung mikrosentrifuga beserta QIAprep spin column disentrifugasi pada kecepatan 13000 rpm selama satu menit (elusi kedua).

 

 

 

HASIL DAN PEMBAHASAN

Plasmid adalah molekul DNA sirkuler berukuran relatif kecil di luar kromosom yang terdapat di dalam sel prokariot, khususnya bakteri. Plasmid tersebar luas di antara organisme prokariot dengan ukuran yang bervariasi dari sekitar 1 kb hingga lebih dari 250 kb (1 kb = 1000 pb).
Agar dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memenuhi syarat-syarat berikut ini:

1. mempunyai ukuran relatif kecil bila dibandingkan dengan pori dinding sel inang sehingga dapat dengan mudah melintasinya,

2. mempunyai sekurang-kurangnya dua gen marker yang dapat menandai masuk tidaknya plasmid ke dalam sel inang,

3. mempunyai tempat pengenalan restriksi sekurang-kurangnya di dalam salah satu marker yang dapat digunakan sebagai tempat penyisipan fragmen DNA, dan

4. mempunyai titik awal replikasi (ori) sehingga dapat melakukan replikasi di dalam sel inang.

Pada dasarnya upaya untuk mendapatkan suatu produk yang diinginkan melalui teknologi DNA rekombinan melibatkan beberapa tahapan tertentu. Tahapan-tahapan tersebut adalah isolasi DNA genomik/kromosom yang akan diklon, pemotongan molekul DNA menjadi sejumlah fragmen dengan berbagai ukuran, isolasi DNA vektor, penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan, transformasi sel inang menggunakan molekul DNA rekombinan, reisolasi molekul DNA rekombinan dari sel inang, dan analisis DNA rekombinan.

Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel, yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim. Langkah berikutnya adalah lisis sel. Bahan-bahan sel yang relatif lunak dapat dengan mudah diresuspensi di dalam medium bufer nonosmotik, sedangkan bahan-bahan yang lebih kasar perlu diperlakukan dengan deterjen yang kuat seperti triton X-100 atau dengan sodium dodesil sulfat (SDS). Pada eukariot langkah ini harus disertai dengan perusakan membran nukleus. Setelah sel mengalami lisis, remukan-remukan sel harus dibuang. Biasanya pembuangan remukan sel dilakukan dengan sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan fenol atau pelarut organik seperti kloroform untuk kemudian disentrifugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. DNA yang telah dibersihkan dari protein dan remukan sel masih tercampur dengan RNA sehingga perlu ditambahkan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA yang telah diisolasi tersebut kemudian dimurnikan dengan penambahan amonium asetat dan alkohol atau dengan sentrifugasi kerapatan menggunakan CsCl.

Teknik isolasi DNA tersebut dapat diaplikasikan, baik untuk DNA genomik maupun DNA vektor, khususnya plasmid. Untuk memilih di antara kedua macam molekul DNA ini yang akan diisolasi dapat digunakan dua pendekatan. Pertama, plasmid pada umumnya berada dalam struktur tersier yang sangat kuat atau dikatakan mempunyai bentuk covalently closed circular (CCC), sedangkan DNA kromosom jauh lebih longgar ikatan kedua untainya dan mempunyai nisbah aksial yang sangat tinggi. Perbedaan tersebut menyebabkan DNA plasmid jauh lebih tahan terhadap denaturasi apabila dibandingkan dengan DNA kromosom. Oleh karena itu, aplikasi kondisi denaturasi akan dapat memisahkan DNA plasmid dengan DNA kromosom.

Pendekatan kedua didasarkan atas perbedaan daya serap etidium bromid, zat pewarna DNA yang menyisip atau melakukan interkalasi di sela-sela basa molekul DNA. DNA plasmid akan menyerap etidium bromid jauh lebih sedikit daripada jumlah yang diserap oleh DNA kromosom per satuan panjangnya. Dengan demikian, perlakuan menggunakan etidium bromid akan menjadikan kerapatan DNA kromosom lebih tinggi daripada kerapatan DNA plasmid sehingga keduanya dapat dipisahkan melalui sentrifugasi kerapatan.

DNA plasmid merupakan wadah yang digunakan untuk kloning gen, sehingga DNA plasmid harus di pisahkan dari DNA kromosom. DNA plasmid mempunyai ukuran yang jauh lebih kecil daripada DNA kromosom. Untuk memisahkan DNA plasmid, maka memerlukan perlakuan yang sedikit berbeda dengan prosedur di atas. Pertama, membran sel dilisis dengan penambahan detergen. Proses ini membebaskan DNA kromosom, DNA plasmid, RNA, protein dan komponen lain. DNA kromosom dan protein diendapkan dengan penambahan potasium. DNA + protein + potasium yang mengendap dipisahkan dengan cara sentrifugasi. Supernatan yang mengandung DNA plasmid, RNA dan protein yang tersisa dipisahkan. Kemudian ditambahkan RNase dan protese untuk mendegradasi RNA dan protein. Akhirnya DNA plasmid dapat dipresipitasi menggunakan etanol.

Gen-gen yang terdapat di dalam plasmid pada umumnya tidak esensial bagi pertumbuhan dan kelangsungan hidup individu bakteri, tetapi sering kali menyandi sintesis protein untuk resistensi terhadap antibiotik. Dalam rekayasa genetika plasmid sering digunakan sebagai vektor untuk membawa gen-gen tertentu yang diinginkan ke dalam suatu sel inang. Gen-gen tersebut selanjutnya akan mengekspresikan produk komersial tertentu seperti insulin, interferon, dan berbagai enzim.

Plasmid yang diisolasi berasal dari bakteri. Proses ini dikenal sebagai proses mini preparation karena jumlahnya hanya sekitar 1-20µg. Sedangkan untuk jumlah yang lebih besar (100-200µg) dinamakan midi preparation dan maxi preparation untuk jumlah yang lebih besar dari 200 µg.

Inti dari isolasi plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian dari debris membran sel, organel sel dan pengotor lainnya. Metode yang digunakan untuk isolasi plasmid, yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis, alkaline lysis, dan enzimatic digestion. Metode yang paling banyak digunakan dalam isolasi ini adalah metode alkaline lysis. Variasi bentuk DNA memiliki perbedaan sifat pada keadaan alkalis.

DNA kromosom dan DNA plasmid dapat merenaturasi dengan membutuhkan lama waktu yang berbeda. Tahapan yang harus dilalui selama proses ini adalah resuspention, lysis, neutralization, dan clearing of lysate. Pada tahap resuspensi, pellet sel hasil dentrifuge diresuspensikan dalam buffer STE (Saline Tris EDTA) pH 8. Adanya EDTA ini berfungsi sebagai pengkelat magnesium kalsium yang berperan dalam menjaga stabilitas membran plasma. Selain itu EDTA juga menghambat DNAse sehingga molekul DNA tidak terdenaturasi. Tris Saline menjaga pH larutan sehingga DNA tetap stabil. Tahap lysis tetap menggunakan pelet hasil sentrifuge pada tahap sebelumnya. Pellet ini diresuspensikan ke dalam buffer lisis yang terdiri dari: SDS 10% untuk menghancurkan membran sel dan denaturasi protein, NaOH untuk mendenaturasi DNA dan mulai menghidrolisis RNA, enzim lisosim menghancurkan dinding sel bakteri, dan larutan glukosa untuk meningkatkan tekanan osmotik di luar sel yang mampu membantu proses pelisisan. DNA plasmid dan DNA kromosomal akan terdenaturasi dengan cara yang berbeda dengan menggunakan NaOH, karena plasmid berbentuk sirkuler maka setelah mengalami denaturasi bentuknya akan tetap utuh. DNA kromosomal yang berbentuk linier akan segera kehilangan bentuknya setelah terdenaturasi. Selanjutnya adalah tahap neutralizer, dengan menambahkan larutan penetralisir yang berisi kalium asetat dan asam asetat pada pH 5. Kegunaan dari asam asetat adalah untuk menetralkan pH sehingga pH tidak basa dan DNA bisa renaturasi.

Penambahan kalium asetat akan menyebabkan renaturasi plasmid, mengendapnya single stranded DNA karena molekulnyayang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar garam tinggi, pembentukan KDS yang tidak larut sehingga SDS dapat dengan mudah terbuang. Yang perlu diperhatikan pada tahap ini adalah proses renaturasi pada DNA plasmid lebih cepat daripada renaturasi dari DNA kromosomal. Selain itu pada saat penambahan larutan lisis ini sebaiknya tidak digunakan vortex atau sentrifugasi yang berlebihan karena akan ikut menyebabkan DNA kromosomal menjadi lebih kecil sehingga akan terlarut pada supernatant. Kemudian masuk ke tahap clearing of lysates, pada tahap ini diperoleh supernatant yang berisi DNA plasmid. Penambahan etanol absolut berguna untuk mengendapkan plasmid karena perbedaan polaritas, etanol yang ditambahkan harus dingin agar lebih banyak lagi DNA plasmid yang mengendap. Selanjutnya untuk menghilangkan pengotor yang masih ada ditambahkan etanol 70% sehingga sisa etanol yang tersisa dapat diuapkan dengan evaporasi. Plasmid yang didapatkan berupa pellet dilarutkan kembali dengan ddH₂O sehingga dapat dilakukan analisis lebih lanjut dengan menggunakan elektroforesis.

 

Daftar Referensi

Gaffar, S. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekuler. 2007. Universitas Padjajaran.

 

ACARA II.

RESTRIKSI DNA PLASMID

LANDASAN TEORI

Teknologi DNA rekombinan merupakan suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah sulitnya memurnikan protein dan materi lainnya dari suatu organisme dalam jumlah besar. Salah satu teknik yang digunakan dalam teknologi DNA rekombinan adalah teknik pemotongan DNA (restriksi DNA). Molekul DNA rekombinan dapat diperoleh dengan cara memotong DNA vektor pada tempat tertentu yang memiliki daerah pemotongan yang sama dengan hasil pemotongan DNA kromosom. Manipulasi pemotongan DNA dilakukan oleh enzim yang disebut endonuklease restriksi.

Beberapa enzim seperti BamHI, EcoRI dan PstI dapat memotong masing-masing strand DNA. Molekul DNA yang dihasilkan memiliki ujung lengket yang kemudian dapat berasosiasi dengan pasangan basa komplementer pada beberapa fragmen DNA lain yang juga telah dipotong dengan enzim restriksi.

TUJUAN

Melihat cara kerja pemotongan DNA plasmid

BAHAN DAN ALAT

1. Plasmid pUC19

2. Enzim restriski (PstI)

3. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)

4. Tabung mikrosentrifuga

5. Sarung tangan

6. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

7. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)

8. termometer

9. Lemari pendingin (Frezer)

10. Kamera Digital

CARA KERJA

1. Vektor pUC19 dipotong dengan enzim restriksi yang sama dengan pemotongan DNA genom, yaitu enzim PstI.

2. Optimasi reaksi restriksi sebelumya dilakukan terlebih dahulu untuk memastikan DNA dapat terpotong sempurna dengan kondisi optimasi tersebut. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml, dengan komposisi Buffer E, BSA, DNA dan PstI

3. Reaksi restriksi dipersiapkan dalam tabung mikrosentrifuga berukuran 1 ml sesuai dengan hasil optimasi reaksi restriksi. Misalkan reaksi restriksi bekerja secara optimum dengan komposisi Buffer E sebanyak 5 µl, BSA sebayak 0,5 µl, DNA pUC19 sebayak 20 µl, dan PstI sebayak 2 µl untuk vinal volume 50 µl.

4. Campuran reaksi dihomogenkan sebentar menggunakan mikrosentrifuga selama 1-2 detik. Tabung mikrosentrifuga diketuk sebentar untuk memastikan campuran sudah tersuspensi.

5. tabung mikrosentrifuga yang berisi campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu 37 ⁰C selama 4 jam menggunakan pemanas air (Water Bath).

6. tabung mikrosentrifuga selanjutnya diinkubasi pada suhu 70 ⁰C selama 10 menit menggunakan Water Bath. Hal ini dilakukan untuk inaktifasi enzim restriksi.

7. larutan DNA hasil restriksi disimpan di dalam Frezer.

 

HASIL DAN PEMBAHASAN

Molekul plasmid yang digunakan sebagai vektor harus dipotong untuk membuka DNA lingkaran, sehingga molekul DNA asing bisa disisipkan. Enzim restriksi merupakan suatu endonuklease yang mengenal urutan spesifik pada molekul DNA dan memotong pada urutan yang spesifik tersebut. Sisi pengenalan enzim restriksi umumnya merupakan suatu polindrom, dimana urutan nukleotida rantai atas sama dengan urutan nukleotida rantai bawah. Enzim restriksi hanya terdapat pada beberapa bakteri, dan berfungsi untuk mempertahankan diri dari infeksi bakteriofaga. Contoh beberapa enzim restriksi dan sisi pengenalannya.

Tahap kedua dalam kloning gen adalah pemotongan molekul DNA, baik genomik maupun plasmid. Perkembangan teknik pemotongan DNA berawal dari saat ditemukannya sistem restriksi dan modifikasi DNA pada bakteri E. coli, yang berkaitan dengan infeksi virus atau bakteriofag lambda (l). Virus l digunakan untuk menginfeksi dua strain E. coli, yakni strain K dan C.  Jika l yang telah menginfeksi strain C diisolasi dari strain tersebut dan kemudian digunakan untuk mereinfeksi strain C, maka akan diperoleh l progeni (keturunan) yang lebih kurang sama banyaknya dengan jumlah yang diperoleh dari infeksi pertama. Dalam hal ini, dikatakan bahwa efficiency of plating (EOP) dari strain C ke strain C adalah 1.  Namun, jika l yang diisolasi dari strain C digunakan untuk menginfeksi strain K, maka nilai EOP-nya hanya 10^-4. Artinya, hanya ditemukan l progeni sebanyak 1/10.000 kali jumlah yang diinfeksikan. Sementara itu, l yang diisolasi dari strain K mempunyai nilai EOP sebesar 1, baik ketika direinfeksikan pada strain K maupun pada strain C. Hal ini terjadi karena adanya sistem restriksi/modifikasi (r/m) pada strain K.

Pada waktu bakteriofag l yang diisolasi dari strain C diinfeksikan ke strain K, molekul DNAnya dirusak oleh enzim endonuklease restriksi yang terdapat di dalam strain K. Di sisi lain, untuk mencegah agar enzim ini tidak merusak DNAnya sendiri, strain K juga mempunyai sistem modifikasi yang akan menyebabkan metilasi beberapa basa pada sejumlah urutan tertentu yang merupakan tempat-tempat pengenalan (recognition sites) bagi enzim restriksi tersebut.

DNA bakteriofag l yang mampu bertahan dari perusakan oleh enzim restriksi pada siklus infeksi pertama akan mengalami modifikasi dan memperoleh kekebalan terhadap enzim restrisksi tersebut. Namun, kekebalan ini tidak diwariskan dan harus dibuat pada setiap akhir putaran replikasi DNA. Dengan demikian, bakteriofag l yang diinfeksikan dari strain K ke strain C dan dikembalikan lagi ke strain K akan menjadi rentan terhadap enzim restriksi. Metilasi hanya terjadi pada salah satu di antara kedua untai molekul DNA. Berlangsungnya metilasi ini demikian cepatnya pada tiap akhir replikasi hingga molekul DNA baru hasil replikasi tidak akan sempat terpotong oleh enzim restriksi. Enzim restriksi dari strain K telah diisolasi dan banyak dipelajari. Selanjutnya, enzim ini dimasukkan ke dalam suatu kelompok enzim yang dinamakan enzim restriksi tipe I.  Banyak enzim serupa yang ditemukan kemudian pada berbagai spesies bakteri lainnya. Pada tahun 1970 T.J. Kelly menemukan enzim pertama yang kemudian dimasukkan ke dalam kelompok enzim restriksi lainnya, yaitu enzim restriksi tipe II. Ia mengisolasi enzim tersebut dari bakteri Haemophilus influenzae strain Rd, dan sejak saat itu ditemukan lebih dari 475 enzim restriksi tipe II dari berbagai spesies dan strain bakteri. Semuanya sekarang telah menjadi salah satu komponen utama dalam tata kerja rekayasa genetika. Enzim restriksi tipe II antara lain mempunyai sifat-sifat umum yang penting sebagai berikut:

1.  

   1. mengenali urutan tertentu sepanjang empat hingga tujuh pasang basa di dalam molekul DNA

   2. memotong kedua untai molekul DNA di tempat tertentu pada atau di dekat tempat pengenalannya

   3. menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan berbagai ukuran dan urutan basa.

Sebagian besar enzim restriksi tipe II akan mengenali dan memotong urutan pengenal yang mempunyai sumbu simetri rotasi. Pemberian nama kepada enzim restriksi mengikuti aturan sebagai berikut. Huruf pertama adalah huruf pertama nama genus bakteri sumber isolasi enzim, sedangkan huruf kedua dan ketiga masing-masing adalah huruf pertama dan kedua nama petunjuk spesies bakteri sumber tersebut. Huruf-huruf tambahan, jika ada, berasal dari nama strain bakteri, dan angka romawi digunakan untuk membedakan enzim yang berbeda tetapi diisolasi dari spesies yang sama.

Tempat pemotongan pada kedua untai DNA sering kali terpisah sejauh beberapa pasang basa. Pemotongan DNA dengan tempat pemotongan semacam ini akan menghasilkan fragmen-fragmen dengan ujung 5’ yang runcing karena masing-masing untai tunggalnya menjadi tidak sama panjang. Dua fragmen DNA dengan ujung yang runcing akan mudah disambungkan satu sama lain sehingga ujung runcing sering pula disebut sebagai ujung lengket (sticky end) atau ujung kohesif.

Hal itu berbeda dengan enzim restriksi seperti Hae III, yang mempunyai tempat pemotongan DNA pada posisi yang sama. Kedua fragmen hasil pemotongannya akan mempunyai ujung 5’ yang tumpul karena masing-masing untai tunggalnya sama panjangnya. Fragmen-fragmen DNA dengan ujung tumpul (blunt end) akan sulit untuk disambungkan. Biasanya diperlukan perlakuan tambahan untuk menyatukan dua fragmen DNA dengan ujung tumpul, misalnya pemberian molekul linker, molekul adaptor, atau penambahan enzim deoksinukleotidil transferase untuk menyintesis untai tunggal homopolimerik 3’.

DAFTAR REFERENSI

http://karya-ilmiah.um.ac.id/index.php/disertasi/article/view/1045

Gaffar, S. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekuler. 2007. Universitas Padjajaran.

ACARA III.

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSA

LANDASAN TEORI

Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya. Gel yang biasa digunakan antara lain agarosa. Elektroforesis gel agarosa dapat dilakukan untuk memisahkan sampel DNA dengan ukuran dari beberapa ratus hingga 20.000 pasang basa (bp).

Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif (anode). Makin besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya. Berat molekul suatu fragmen DNA dapat diperkirakan dengan memsumuraningkan laju migrasinya dengan laju migrasi fragmen-fragmen molekul DNA standar (DNA marker) yang telah diketahui ukurannya. Visulisasi DNA selanjutnya dilakukan di bawah paparan sinar ultraviolet setelah terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet.

Teknik gel elektroforesis makin berkembang dan disempurnakan, hingga 12 tahun kemudian ditemukan gel poliakrilamida (PAGE = Polyacrilamide Gel Electrophoresis) yang terbentuk melalui proses polimerisasi akrilamida dan bis-akrilamida. PAGE ini sanggup memisahkan campuran DNA/RNA atau protein dengan ukuran lebih besar. Meskipun aplikasi elektroforesis makin berkembang luas, namun ternyata teknik ini masih menyerah jika digunakan untuk memisahkan DNA dengan ukuran yang super besar, misalnya DNA kromosom. Campuran DNA kromosom tidak dapat dipisahkan meskipun ukuran mereka berbeda-beda.

 

TUJUAN

Melihat cara kerja elektroforesis gel agarosa

BAHAN DAN ALAT

1. DNA marker, misalnya DNA λ yang dipotong dengan HindIII

2. Sampel DNA, misalnya :

   1. DNA kromosom bakteri,

   2. DNA plasmid hasil isolasi (uncut)

   3. DNA plasmid hasil restriksi (cut)

3. Agarosa

4. Larutan buffer TAE 50x (242 g tris-base; 57,1 g asam asetat glacial; 100 ml EDTA 0,5 M pH 8; dilarutkan dalam akuades hingga 1000 ml)

5. Akuades

6. Gelas Ukur 1000 ml

7. Labu Erlenmeyer 50 ml

8. Tabung mikrosentrifuga

9. Sarung tangan

10. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

11. Kertas parafilm

12. seperangkat alat elektroforesis

13. Loading dye 6x (0,25% bromophenol blue; 0,25% xylene cyalol; 15% ficoll tipe 4000; EDTA 120 mM)

14. larutan Etidium Bromid (EtBr)

15. UV transluminator

16. Kaca mata UV

17. kamera digital

CARA KERJA

No.	Keterangan	Gambar
	Untuk membuat 20 ml larutan agarosa 1%, timbang 0,2 g agarosa (sudah disiapkan asisten)
	Tambahkan TAE (1X) sampai volume 20 mL
	Didihkan agarosa sampai larut dan terlihat jernih.
	Biarkan larutan agarosa mendingin (55ºC) dan tambahkan 1 uL etidium bromida (10 mg/ml) sebelum larutan agarosa dituang ke dalam pencetak gel
	Siapkan pencetak gel dengan menyelotip ke dua ujung pencetak gel dan menempatkan sisir pada salah ujung pencetak gel
	Tuangkan larutan agarosa ke dalam pencetak gel.
	Setelah gel memadat, pindahkankan gel agarosa beserta pencetak gel ke dalam tangki elektroforesis.   Sebelum dipindahkan ke tangki elekstroforesis, selotip pada kedua ujung pencetak gel dilepas terlebih dahulu
	Masukkan 10 µL sampel DNA yang telah dicampur dengan 2 uL loading dye (6X) ke dalam sumur (well) gel agarosa
	Elektroforesis pada 70 Volt sampai penanda warna (biru) bermigrasi di atas gel agarose bagian bawah.
	Setelah elektroforesis selasai, letakkan gel agarosa di atas UV transillumitor dan tutup kaca pelindung dan amati pita DNA
	Dokumentasikan pita DNA yang tampak menggunakan kamera .

 

HASIL DAN PEMBAHASAN

Elektroforesis gel agarosa. Metoda ini didasarkan pada pergerakan mulekul bermuatan dalam media penyangga matriks stabil di bawah pengaruh medan listrik. Media yang umum digunakan adalah gel agarosa atau poliakrilamid. Elektroforesis gel agarosa digunakan untuk memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pb dan dijalankan secara horizontal, sedangkan elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan 1 pb dan dijalankan secara vertikal. Elektroforesis poliakrilamid biasanya digunakan untuk menentukan urutan DNA (sekuensing).

Larutan DNA yang bermuatan negatif dimasukkan ke dalam sumur-sumur yang terdapat pada gel agarosa dan diletakkan di kutup negatif, apabila dialiri arus listrik dengan menggunakan larutan buffer yang sesuai maka DNA akan bergerak ke kutup positif. Laju migrasi DNA dalam medan listrik berbanding terbalik dengan massa DNA. Migrasi DNA terutama ditentukan oleh ukuran panjang dan bentuk DNA. Fragmen DNA yang berukuran kecil akan bermigrasi lebih cepat dibanding yang berukuran besar, sehingga elektroforesis mampu memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran panjangnya. Untuk visualisasi maka ditambahkan larutan etidium bromida yang akan masuk diantara ikatan hidrogen pada DNA, sehingga pita fragmen DNA akan kelihatan dibawah lampu UV. Panjang amplikon bisa diperkirakan dengan membandingkannya dengan pita DNA standar

 

 

Gambarlah pita-pita dna hasil elektroforesis dengan nomor sumuran dan jenis sampelnya. Perkirakan ukuran masing-masing fragmen/pita dengan memsumuraningkannya dengan posisi migrasi pada DNA marker.

 

 

 

Keterangan:

1 = Marka (λ/hind III)

2 = K1 (pUC + HindIII)

3 = K2 (pUC + E. Cory I)

4 = K3 (pUC + Pst I)

5 = K4 (pUC + E. Cory I)

6 = A1 (pUC + E Cory I)

 

7 = A2 (pUC + Pst I)

8 = A3 (pUC + HindIII)

9 = A4 (pUC)

10 = K1 (pUC hasil isolasi)

11 = K2 (pUC hasil isolasi)

 

base pairs (bp)	distance(mm)	log 10 bp	distance unknow	m*distance	y value	unknow bp value
23130	13	4.364176	36	-0.972	3.711	5140.436516
9416	25	3.973866	35	-0.945	3.738	5470.159629
6557	30	3.816705	33	-0.891	3.792	6194.410751
4361	40	3.639586	35	-0.945	3.738	5470.159629
			43	-1.161	3.522	3326.595533
			32	-0.864	3.819	6591.738952
			35	-0.945	3.738	5470.159629
			44	-1.188	3.495	3126.079367
			45	-1.215	3.468	2937.649652
			43	-1.161	3.522	3326.595533

 

 

Elektroforesis dapat digunakan untuk mengetahui ukuran DNA dengan menggunakan DNA marker yang sudah diketahui ukurannya. DNA marker ini berfungsi sebagai pemsumuraning sehingga bisa diketahui perkiraan ukuran DNA sampel. Beberapa hal yang dapat mempengaruhi hasil elektroforesis adalah jumlah DNA di dalam sampel dan kecepatan migrasi DNA yang dipengaruhi oleh ukuran DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, tegangan arus listrik, arah medan listrik, temperatur, keberadaan interchelating agent, komposisi basa, dan komposisi buffer elektroforesis

Berdasarkan hasil praktikum tersebut persamaan regresi logaritmik yang digunakan untuk DNA marker data yang diperoleh: y = -0,027x+4,683; R2 = 0,977 Persamaan logaritmik menghasilkan nilai R2 yang paling mendekati 1. Dengan menggunakan persamaan ini dapat ditentukan ukuran DNA sampel berdasarkan jarak migrasinya:

NO	SUMURAN	distance unknow	unknow bp value
1.	Marka (DNA λ/Hind III)
2.	K1 (pUC + HindIII)	36	5140.436516
3.	K2 (pUC + E. Cory I)	35	5470.159629
4.	K3 (pUC + Pst I)	33	6194.410751
5.	K4 (pUC + E. Cory I)	35	5470.159629
6.	A1 (pUC + E Cory I)	43	3326.595533
7.	A2 (pUC + Pst I)	32	6591.738952
8.	A3 (pUC + HindIII)	35	5470.159629
9.	A4 (pUC)	44	3126.079367
10.	K1 (pUC hasil isolasi)	45	2937.649652
11.	K2 (pUC hasil isolasi)	43	3326.595533

 

Hasil praktikum menunjukkan adanya kesingkronan dengan ukuran dan jarak migrasi DNA marker. Namun ada yang menunjukkan kejanggalan yaitu pada sumuran ke 10 pita DNA tidak jelas sehingga tidak dapat di pengukuran dan perhitungan jarak migrasi dari DNA kurang tepat. Hal ini dimungkinkan saat meletakkan DNA pUc hasil isolasi tidak berada tepat pada sumuran sehingga hasil elektroforesisnya tidak terlihat dengan jelas. Selain itu yang menyebabkan kejanggalan ini adalah perhitungan jarak migrasi dari DNA marker yang kurang tepat karena adanya pita smear atau pita yang tertumpuk sehingga sulit untuk diketahui jarak migrasi pastinya.). Migrasi DNA saat elektroforesis tergantung pada ukuran dan bentuk DNA maka bentuk dari DNA sampel dapat diperkirakan berdasarkan jarak migrasinya. Untuk plasmid yang sama diperoleh lebih dari satu ukuran karena adanya DNA lain, seperti DNA kromosomal dan DNA mitokondria yang bisa saja terikut dalam elektroforesis selain DNA plasmid sehingga diperoleh berbegai macam ukuran DNA. Bentuk DNA plasmid yang diperoleh juga bervariasi, kemungkinan penyebabnya adalah proses renaturasi plasmid yang tidak sempurna sehingga tidak dapat berbentuk sirkular seperti normalnya atau bahkan plasmid tersebut terdenaturasi karena goncangan yang terlalu kencang saat proses isolasi. Hampir semua sumuran menunjukkan adanya RNA karena sumuran yang ditunjukkan berupa smear dan kurang jelas yang merupakan ciri dari RNA saat elektroforesis. Hanya pita no 5 dan 8 saja yang terlihat jelas tanpa adanya smear. Bentuk DNA (plasmid) yang paling cepat termigrasikan menuju kutub positif adalah DNA dengan bentuk supercoiled. Disusul oleh DNA plasmid bentuk supercoiled terdenaturasi, relaxed circular, linear, dan nicked open circular. Hal yang dapat menyebabkan tertumpuknya sumuran ini beragam, mulai dari DNA sampel itu sendiri serta proses elektroforesis yang dilakukan. DNA plasmid yang digunakan untuk proses elektroforesis ini tidak dapat dijamin 100% kemurniannya karena selain DNA plasmid dalam bakeri juga terdapat DNA lain yang mungkin saja terikut, misalnya, pada proses penetralan jika sentrifugasi dan pengocokan dilakukan berlebihan atau terlalu kuat maka DNA kromosomal dapat terlarut dalam supernatant bersama DNA plasmid yang digunakan untuk tahap selanjutnya. Dalam proses elektroforesis itu sendiri banyak hal yang mempengaruhi migrasi DNA, yaitu: ukuran DNA, konsentrasi agarosa, konformasi DNA, tegangan arus listrik, arah medan listrik, temperatur, keberadaan interchelating agent, komposisi basa, dan komposisi buffer elektroforesis.

.

 

DAFTAR REFERENSI

http://www.fp.unud.ac.id/biotek/biologi-sel/teknik-molekuler/

http://www.docstoc.com/docs/16225344/isolasi-plasmid

Gaffar, S. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekuler. 2007. Universitas Padjajaran.

 

ACARA IV.

TRANSFORMASI

LANDASAN TEORI

Transformasi merupakan teknik transfer molekul DNA ke dalam sel inang bakteri misalnya bakteri E.coli. Fenotif Strain E. coli hasil transforman akan berubah karena mendapatkan gen-gen penyandi baru yang dibawa oleh molekul DNA tersebut. Molekul DNA ini biasanya dikemas dalam suatu vektor, misalnya plasmid.

BAHAN ADAN ALAT

1. strain E. coli JM 109

2. media LB cair

3. media cawan LB ampisilin dan media cawan LB tanpa ampisilin

4. media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG

5. es batu

6. shaker-incubator

7. termometer

8. Tabung mikrosentrifuga

9. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)

10. Microsentrifuga 5415D (Eppendorf)

11. pemanas air (water bath) tipe WB-20E (JEIO TECH, Korea)

12. jarum ose

13. batang drugalsky

14. cawan Petri

15. Erlenmeyer

16. shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico, Ltd.)

17. kamera digital.

CARA KERJA

1. Kultur semalam strain E. coli JM 109 dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara memindahkan satu koloni strain E. coli JM 109 ke media LB cair. Inkubasi di dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm pada suhu 37^oC selama 16 jam (semalam).

2. Pindahkan kultur E. coli JM 109 hasil inkubasi semalam ke media LB cair 25 ml dengan cara mengambil 250 μl kultur E. coli JM 109 ke dalam media LB cair 25 ml, atau dengan kata lain persumuraningan antara volume media dan volume kultur 10:1, kemudian dilakukan inkubasi dalam shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 125 rpm selama 120 menit (2 jam) pada suhu 37^oC.

3. Sebanyak 1,5 ml kultur hasil inkubasi 2 jam diambil dan dimasukkan ke dalam tabung mikrosentrifuga dan dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.

4. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 μl CaCl2 dingin, diresuspensi kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.

5. Supernatan dibuang kembali dan ke dalam tabung ditambahkan kembali 200 μl CaCl2 dingin, diresuspensi dan diinkubasi dalam es. Dalam perlakuan ini terdapat lima tabung mikrosentrifuga, dua diantaranya untuk inkubasi 2 jam dan 3 lainnya untuk inkubasi 16 jam.

6. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten, salah satunya atau tabung nomor 1 ditambah dengan 10 μl palsmid pUC19 sirkuler, sedangkan tabung nomor 2 tidak ditambah dengan palsmid.

7. Kedua tabung diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit, kemudian diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik dengan suhu 42^oC dan segera dipindahkan ke dalam es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.

8. Tabung mikrosentrifuga ditambahkan media LB hingga 1 ml setelah inkubasi 10 menit, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator pada suhu 37^oC dengan kecepatan rotasi 150 rpm selama 1,5 jam.

9. Sebanyak 100 μl hasil inkubasi ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp untuk kedua tabung. Selain itu, sebanyak 50 μl hasil inkubasi pada tabung nomor 2 ditumbuhkan juga pada media LB tanpa ampisilin. Inkubasi dilakukan selama 16 jam pada suhu 37^oC.

10. Sementara itu, ke dalam tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 16 jam yang masing-masing berisi 200 μl sel kompeten, ditambahkan 10 μl vektor pUC19 sirkuler untuk penentuan efisiensi transformasi (tabung nomor 3), 2 μl vektor pUC19 rekombinan (tabung nomor 4) dan tidak ditambahkan apapun (tabung nomor 5).

11. Ketiga tabung mikrosentrifuga diinkubasi lebih lanjut dalam es selama 20 menit dan diberi kejut panas (heat-shock) selama 90 detik pada suhu 42^oC dan segera dipindahkan ke es untuk diinkubasi kembali selama 10 menit.

12. Tabung mikrosentrifuga selanjutnya ditambahkan dengan media LB hingga 1 ml, dilanjutkan dengan inkubasi dalam shaker-incubator selama 1,5 jam pada suhu 37^oC.

13. Disiapkan media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG dengan cara menambahkan 50 μl X-Gal dan 100 μl IPTG ke media cawan LB/Amp, lalu diinkubasi pada suhu 37^oC selama lebih kurang 30 menit.

14. Hasil inkubasi tabung nomor 3 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp/X-Gal/IPTG sebanyak 100 μl.

15. Tabung nomor 4 disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit. Supernatan dibuang hingga tersisa 100 μl, dan kemudian ditumbuhkan dengan cara plating ke media LB/Amp/X-Gal/IPTG.

16. Hasil inkubasi pada tabung no.5 ditumbuhkan dengan cara plating ke media cawan LB/Amp sebanyak 100 μl dan ke media cawan LB sebanyak 50 μl, dilanjutkan dengan inkubasi selama 16 jam pada suhu 37^oC.

17. Untuk cawan yang berisi E. coli dengan pUC19 sirkuler dilakukan penjumlahan koloni untuk diketahui efisiensi transformasinya.

18. Efisiensi transformasi dihitung dengan cara sebagai berikut

Dimana,

Σkoloni = jumlah koloni putih (dalam cfu)

[pUC19] = konsentrasi pUC19 (dalam ng)

 

HASIL DAN PEMBAHASAN

Tahap berikutnya dalam eksperimen pengklonan gen setelah molekul DNA rekombinan berhasil dikonstruksi adalah memasukkan molekul DNA rekombinan tersebut ke dalam sel hidup yang disebut sel inang. Sel inang yang paling umum digunakan adalah Escherichia coli.. Karena sel dalam E.coli tergolong tidak efisien dalam menyerap DNA. Sel ini memiliki kemampuan alami menyerap DNA asing yang rendah. Untuk memasukkan DNA ke dalam sel bakteri, sel tersebut harus diberi perlakukan agar menjadi sel kompeten, yaitu sel yang mampu menerima DNA dari luar. Kemampuan paling tinggi untuk memasukkan DNA dari luar terjadi pada sel yang berada dalam fase logaritmik, yaitu pada waktu pertumbuhan sel sedang cepat. Perlakukan dengan CaCl₂ menyebabkan dinding sel menjadi lebih permeabel dan bermuatan positif, sehingga dapat menarik DNA yang bermuatan negatif.

Transformasi (pengambilan DNA oleh sel bakteri) dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu : (1) dengan cara heat shock (kejutan panas) dimana campuran sel dan DNA plasmid rekombinan didinginkan dalam waktu yang lama, kemudian di panaskan dengan segera pada suhu 42 ^oC. (2) dengan cara elektroporasi (kejutan listrik) menggunakan suatu alat yang dialiri arus listrik.

Sel kompeten adalah sel yang dapat menyerap DNA karena telah mendapat perlakuan fisik maupun kimia. Sel dapat dibuat kompeten melalui perlakuan dengan garam kalsium klorida (CaCl₂). Fungsi penambahan CaCl₂ pada pembuatan sel kompeten mempengaruhi dinding sel dan mungkin berperan dalam pengikatan DNA pada permukaan sel. Literatur yang sama menyebutkan bahwa penyerapan DNA secara nyata sebenarnya dipengaruhi oleh perlakuan kejut panas. Sel E.coli yang kompeten diberi perlakuan kejut panas untuk membuka pori pada dinding sel bakteri. Inkubasi dengan plasmid akan menyebabkan masuknya plasmid ke dalam sel. Penambahan media LB setelah perlakuan kejut panas berfungsi untuk memenuhi kebutuhan nutrisi dari bakteri setelah mengalami perlakuan yang ekstrem.

Pemasukkan molekul DNA rekombinan ke dalam sel inang disebut transformasi apabila vektor yang digunakan berupa plasmid. Peristiwa ini disebut transformasi karena plasmid dapat mengubah sifat sel inang. Keberhasilan plasmid masuk dan bertahan di dalam sel umumnya dideteksi berdasarkan ekspresi gen marka yang dibawa oleh plasmid tersebut.

Plasmid pUC 19 adalah salah satu vektor plasmid yang sering digunakan dalam biologi molekuler. Plasmid ini mempunyai besar 2,69 kb, jumlah kopi sekitar 500-7000 dan mempunyai peta retriksi seperti tersaji pada gambar .

 

Plasmid pUC19 mempunyai gen penanda, yaitu gen penyandi resisten terhadap ampisilin. Gen penanda tersebut akan mengeksploitasi enzim beta-laktamase ke plasma sel bakteri inang. Enzim tersebut akan mengkatalisa hidrolisis cincin betalaktam, sehinggga menyebabkan bakteri hasil transformasi dengan pUC19 menjadi resisten terhadap ampisilin. Sel inang yang telah mengandung DNA rekombinan dibiakkan dalam medium padat, sehingga membentuk koloni. Koloni yang terbentuk merupakan sekumpulan sel yang identik karena hasil pembiakan sebuah sel. Koloni yang dapat tumbuh pada media seleksi ini adalah koloni yang berasal dari bakteri transforman saja.

 Hasil praktikum transformasi yang telah dilakukan tersaji dalam plate seperti berikut:

 

 

Hasil tersebut menunjukkan pada pUC yang ditambah LB amphisilin (LB-Amp), setelah dilakukan penghitungan menghasilkan 274 koloni, sedangkan pada pUC LB Non-Amp koloni terlalu banyak (TBUD). Pada Non-pUC LB non-Amp hasilnya juga terdapat banyak koloni (TBUD). Hasil transformasi yang tidak benar terjadi pada hasil Non-pUC LB-Amp yang seharusnya kosong, namun hasil yang didapat dari praktikum kita terdapat kontaminan. Hal ini dimungkinkan amphisilin telah rusak, karena kepanasan, atau mungkin disebabkan karena dalam berkerja kurang aseptis atau kurang steril. Pada cawan sampel terjadi pertumbuhan bakteri E.coli transforman yang telah membentuk koloni tunggal. Transformasi antara sel yang kompeten dapat terjadi saat bakteri ditumbuhkan dalam media dan dapat menyebabkan kesalahan pada perhitungan laju transformasi. Hal ini dapat diperbaiki dengan penambahan EDTA pada media seleksi.

Peningkatan efisiensi transformasi dapat dilakukan dengan modifikasi metode standar CaCl₂. Konsentrasi optimum CaCl₂ adalah 75 mM. Sel kompeten yang disimpan dalan -20^oC dapat bertahan hingga 7 hari, sementara penyimpanan pada -70^oC dapat bertahan hingga 15 hari. Media LB diganti dengan media SOC yang berisi tripton, ekstrak ragi, NaCl, MgCl₂, MgSO₄, dan glukosa. Media ini mendukung pertumbuhan transforman yang lebih cepat. Sementara itu, pada saat transformasi dengan plasmid ditambahkan DMSO dan PEG₈₀₀₀. Penambahan ini mampu meningkatkan efisiensi transformasi antara 100-300 kali lipat.

 

DAFTAR REFERENSI

http://journal.ui.ac.id/upload/artikel/Transformasi%20fragmen_Mangunwardoyo.pdf

http://afie.staff.uns.ac.id/2008/12/11/transformasi-plasmid-dna-sel-kompeten-metode-cacl2/

http://etd.eprints.ums.ac.id/2340/1/K100040214.pdf

Gaffar, S. 2007. Buku Ajar Bioteknologi Molekuler. 2007. Universitas Padjajaran.

 

Lampiran 1. Skema Kerja Restriksi DNA plasmid

Optimasi reaksi pemotongan DNA (Modifikasi Promega, 2005)

No.	Komponen	P1	P2	P3
1.	ddH2O	22,5 µl	22,5 µl	22,5 µl
2.	Buffer E	5 µl	5 µl	5 µl
3.	BSA	0,5 µl	0,5 µl	0,5 µl
4.	DNA
	pUC19	20 µl	20 µl	20 µl
5.	PstI	2 µl	-	-
6.	HinfI	-	2 µl	-
7.	HindIII	-	-	2 µl
Jumlah		50 µl	50 µl	50 µl

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Lampiran 2. Media Pertumbuhan Bakteri

 

1. Media Cawan Agar Luria-Bertani (LB) 100 ml

   • Bacto tryptone 1 gram

   • Bacto yeast extract 0,5 gram

   • NaCl 0,5 gram

   • Agar 2 gram

Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian diautoklaf.

1. Media Cair Luria-Bertani (LB) 100 ml

• Bacto tryptone 1 gram

• Bacto yeast extract 0,5 gram

• NaCl 0,5 gram

Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian diautoklaf.

1. Media Cawan Agar Luria-Bertani/Ampisilin (LB/Amp) 100 ml

• Bacto tryptone 1 gram

• Bacto yeast extract 0,5 gram

• NaCl 0,5 gram

• Ampisilin (100 μg/ml) 100 μl

• Agar 2 gram

Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian diautoklaf.

1. Media Cair Luria-Bertani/Ampisilin (LB/Amp) 100 ml

• Bacto tryptone 1 gram

• Bacto yeast extract 0,5 gram

• NaCl 0,5 gram

• Ampisilin (100 μg/ml) 100 μl

Ditera dengan akuades hingga 100 ml. Dipanaskan hingga mendidih, kemudian diautoklaf.

1. Media Cawan Agar LB/Amp/X-Gal/IPTG

Buat media agar LB/Amp seperti diatas, kemudian ditambahkan 100 μl IPTG 100 mM dan 50 μl X-Gal 50 mg/ml. Ratakan dengan cara dispread hingga kering, inkubasi pada suhu 37^oC selama 30 menit sebelum digunakan.

 

Komposisi Bufer dan Larutan

1. TAE bufer 50X (Annymous, http://www.6mgel.com/50x_tae_buffer_1_liter.htm)

1.  

   • Tris-base 242 g

   • Glacial acetic acid 57,1 g

   • EDTA 0,5 M pH 8,0 100 ml

Semua komponen dilarutkan ke dalam akuades secukupnya, kemudian tambahkan HCl untuk menentukan pH 7,6-7,8. Tera dengan akuades hingga volume akhir 1000 ml. Dapat disimpan pada suhu ruang.

2. Loading buffer 6X (Anonymous, http://www.bioron.net/products/dna-and-dna-markers/loading-buffer/)

• Bromophenol blue 0,25%

• Xylene cyanol 0,25%

• Ficoll tipe 400 15%

• EDTA 120 mM

Semua komponen dilarutkan hingga homogen. Dapat disimpan pada suhu ruang.

3. Larutan stok IPTG (0,1 M) (Promega, 2003)

- IPTG 1,2 g

Tambahkan air sampai volume akhir 50 ml. Sterilisasi secara filtrasi kemudian simpan pada 4^o C.

4. Larutan X-Gal (2 ml) (Promega, 2003)

- 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactoside 100 mg

Larutkan dalam 2 ml N,N’-dimethyl-formamide. Tutup dengan aluminium foil kemudian simpan dalam -20^o C.

 

 

Kloning melekular dan karakterisasi dari transporter prostaglandin babi (SLCO2A1) : mengevaluasi perannya di F4 yang menyebabkan diare

Prostaglandin adalah turunan asam lemak anionik dari subclass eicosanoid. Prostglandin disintesis oleh inti sel (kecuali limfosit), dan berperan sebagai autokrin/parakrin/endokrin atau sebagai molekul sinyal intrakrin yang mengikat spesifik reseptor. Prostglandin berperan dalam proses fisiologis yaitu reproduksi, pernafasan, kardiovaskular homeostasis, berpikir, pencernaan, eksresi di ginjal, pembentukan tulang, kekebalan, peradangan, asma dan alzheimer.

Transporter pada prostaglandin babi yaitu SLCO2A1 dikloning pertama kali pada tikus kemudian manusia. SLCO2A1 deketahui sebagai gen penyebab penyakit pada manusia. Pada babi SLCO2A1 menyebabkan diare, penyebabnya adalah infeksi bakteri F4 yaitu dengan menghasilkan enterotoxin yang merangsang sekresi air dan elektrolit sehingga sering menyebabkan kematian pada kelahiran baru akibat terjadinya diare.

Gen SLCO2A1 diatur di 14 ekson, termasuk didalamnya yaitu open reading frame (kerangka baca pembuka) terdiri dari 1935 bp, menyandikan 12 organik transmembran permukaan sel anion transporter dari 644 AA. -388 sampai -5 di upstream (CpG)₄₈ yang merupakan pulau yang berisi sejumlah promotor, termasuk kotak TATA. Alternatif potensial promotor ditemukan di daerah upstrream -973 sampai -700. Tidak ada sinyal konsensus polyadenilasi ditemukan di 3’UTR. Pengulangan sekuen ditemukan dalam 15 % dari semua sekuen noncoding (tidak menyandikan asam amino).

Untuk mengetahui malfungsi protein, jaringan distribusi diamati. Ekspresi mRNA ditemukan di kelenjar adrenal, kandung kemih, usus buntu, usus besar (sentripetalcoil dan sentrifugal coil), diafragma, duodenum, kandung empedu, hati, ileum, jejunum, ginjal, hati, longidimus dorsi, otot, paru-paru, kelenjar getah bening, mesentrium, rektum, limfa, perut, lidah dan saluran kencing tapi tidak ditemukan di aorta, esofagus dan pankreas.

Daerah promotor dan ekson (termasuk daerah splicing) dari SLCO2A1 disekuen di dalam reseptor positif 5 F4ab/ac dan reseptor negatif 5 F4ab/ac pada babi. Ditemukan dua mutasi diam dan 2 missense mutasi (keduanya yaitu S menuju L pada posisi 360 dan 633 ), tetapi tidak satupun berkerjasama dengan reseptor fenotip F4ab/ac. Selain itu, tidak ada fenotip terkait ekspresi mRNA yang berbeda atau alternatif lain/abberant splicing/poliadenilasi ditemukan di jejunum.

Kloning malekular dan karakterisasi SLCO2A1 memberikan pengetahuan tentang transporter. Disini juga diketahui keterlibatan reseptor dalam F4 enterotoxigenic pada E. coli yang menyebabkan diare pada bayi. Karena tidak ada perbedaan yang terkait fenotip yang dibuktikan melalui urutan gen maupun dalam transkripsi reseptor positif F4ab/ac dan reseptor negatif F4ab/ac pada babi, SLCO2A1 disimpulkan bukan merupakan reseptor untuk F4 bakteri.

sumber :

Molecular cloning and characterization of the porcine prostaglandin transporter (SLCO2A1): evaluation of its role in F4 mediated neonatal diarrhoea. 6 oktober 2009

Mario Van Poucke¹ , Vesna Melkebeek² , Tim Erkens¹ , Alex Van Zeveren¹ , Eric Cox² and Luc J Peelman¹

http://www.biomedcentral.com/1471-2156/10/64

JEANNI NOVA SURBAKTI

P2BA09005

Teknik kloning diperkenalkan pada saat kelahiran domba Dolly pada tahun 1997. Dolly diproduksi melalui teknik kloning antara inti sel (nukleus) tubuh biri-biri betina dipindahkan ke sel oosit domba, dimana oosit domba tersebut dirubah terlebih dahulu. Kemudian inti sel tubuh biri-biri betina dan sel oosit domba bergabung melalui proses elektrofusi. Penggabungan tersebut menghasilkan keturunan yang genomenya sama persis dengan biri-biri betina. Penelitian membuktikan reproduksi SCNT (somatic cell nuklear transfer/ pemindahan inti sel somatik) menghasilkan clone pengenal tambahan pada species dengan menggunakan metode orisinil dan metode lain yang terkait.

Perkembangan kloning dengan menggunakan sel somatik manusia menimbulkan perdebatan antara pekerja hukum, akademisi, pemimpin agama, agensi nasional dan internasional, pihak sosial dan lainya. Sampai sekarang, reproduksi SCNT di laboratorium hewan tidak tepat guna kerena jumlah kelahiran sedikit. Hal ini juga dihubungkan dengan efek membahayakan pada kelahiran dan dengan tingginya kematian janin dan kematian saat kelahiran baru. Walaupun, perhatian tentang keamanan janin dan kelahiran baru hanya akan menjadikan reproduksi SCNT tidak etik untuk manusia., kemajuan pada kloning hewan hanya mengindikasikan bahwa memperhatikan keamanan mungkin hanya hambatan yang bersifat sementara untuk reproduksi SCNT manusia. Para peneliti mengusulkan menggunakan SCNT untuk menghasilkan batang sel embrionik manusia yang membutuhkan transplantasi organ atau jaringan. Jika dilakukan, perkembangan SCNT untuk tujuan ilmu pengobatan, dimana SCNT yang terdapat di dalam embrio tidak dapat dipindahkan ke ibu hamil.

Reproduksi SCNT sebagai sesuatu yang tidak etik

Reproduksi SCNT merupakan sesuatu yang dianggap tidak etik jika dipandang dari nilai-nilai dan tradisi. Pandangan secara umum, seorang anak dihasilkan melalui penggabungan dua garis silsilah (perkawinan). Dengan reproduksi SCNT , melalui tangan-tangan ahli, seorang anak akan dihasilkan malalui prosedur aseksual (tanpa perkawinan) dan akan mempunyai genome sesuai yang diinginkan orang tuanya. Reproduksi SCNT lebih dipandang sebagai bentuk replikasi genome daripada reproduksi.

Reproduksi SCNT sebagai sesuatu yang etik

Reproduksi SCNT merupakan sesuatu yang dianggap etik jika terdapat kasus pada pasangan yang tidak subur dan pada pasangan yang mempunyai penyakit genetik yang dapat menurun pada anaknya. Pada kasus pasangan yang salah satunya tidak subur, dapat menggunakan donor sperma atau donor ovum dimana sperma dan ovum disisipi genome somatiknya.dengan reproduksi SCNT kemungkinan pasangan ikut berpartisipasi menurunkan sifat genetik ke keturunannya.

Pada kasus pasangan dengan genetik berisiko menyebabkan penyakit keturunan. Dengan menggunakan reproduksi SCNT, gen-gen yang berperan menyebabkan penyakit keturunan dapat di tolak sehingga genome anak sesuai yang diinginkan.

Reproduksi SCNT sebagai sesuatu yang etik tapi tidak pasti

Reproduksi SCNT adalah tidak etik karena menyebabkan resiko kepada bayi dan janin, tetapi mereka belum siap menerima atau menolak prosedur. Mereka mempertimbangkan pendapat bahwa reproduksi SCNT di keturunan, keluarga dan sosial, mereka tidak yakin bahwa reproduksi SCNT akan menjadi keluarga yang sah atau reproduksi yang memenuhi kebutuhan saja.

Sumber : Human somatic cell nuclear transfer
(cloning)

FERTILITY AND STERILITYt
VOL. 74, NO. 5, NOVEMBER 2000
Copyright ©2000 American Society for Reproductive Medicine
Published by Elsevier Science Inc.

Printed on acid-free paper in U.S.A.

www.asrm.org/Media/Ethics/cloning.pdf